KLONING

Oleh: Janatun Na’imah

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Brawijaya

1.      Pendahuluan

Bioteknologi merupakan ilmu yang mempelajari tentang pemanfaatan makhluk hidup baik itu bakteri, fungi, virus dan organisme hidup lainnya untuk menghasilkan suatu poduk yang memiliki nilai ekonomi tinggi serta bermanfaat bagi kesejahteran manusia. Pada zaman sekarang ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya pada bidang ilmu biologi saja, melainkan juga berkembang pada bidang-bidang ilmu murni dan terapan lain seperti medis, biokimia, komputer, genetika, biologi molekuler, dan mikrobiologi. Salah satu aplikasi bioteknologi di bidang medis, yaitu pembuatan vaksin, antibiotik dan insulin.

Pada zaman sekarang, perkembangan bioteknologi sangat pesat di negara maju dan berkembang yang ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi seperti rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. perkembangan bioteknologi tersebut memungkinkan kita untuk untuk meningkatkan mutu suatu produk dalam bidang pangan, medis, maupun bidang kehidupan lainnya. Bioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut. Salah satu penerapan bidang bioteknologi yang sering dibicarakan adalah Kloning yang bermanfaat bagi kehidupan manusia baik itu dalam bidang pengobatan maupun yang lainnya. Beberapa penelitian yang melibatkan spesies-spesies lain telah dilakukan dan menunjukkan bahwa berbagai spesies hewan dapat dikloning lewat transpalasi inti. Hewan kloning yang dihasilkan lewat trasnplantasi inti sangat tidak efisisen, akan tetapi fakta menunjukkan bahwa perkembangan kloning sangat bermanfaat terhadap kehidupan manusia, seperti dalam pengembangan obat atau insulin untuk suatu penyakit, sehingga perkembangan pengetahuan tentang kloning seperti proses kloning, teknik kloning serta manfaat kloning harus dipahami secara benar.

2. Pembahasan

2.1  Pengertian dan Teknik Kloning

Kloning merupakan salah satu bioteknologi yang sangat bermanfaat untuk memultiplikasi genotip hewan yang memiliki keunggulan tertentu dan preservasi hewan yang hampir punah. Produksi hewan kloning lewat transfer inti sel somatik melibatkan suatu seriprosedur yang kompleks, seperti kultur sel donor, maturasi oosit in vitro, enukleasi, injeksi sel atau inti, fusi, aktivasi, kultur in vitro, rekonstruksi embryo dan transfer embrio. Apabila salah satu dari tahap-tahap ini kurang optimal maka akan mempengaruhi produksi embrio atau hewan kloning. Kloning juga dapat didefinisikan sebagai tindakan menggandakan atau mendapatkan keturunan jasad hidup tanpa fertilisasi, tetapi mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan kemungkinan besar mempunyai fenotib yang sama. Kloning bertujuan untuk mendapatkan keturunan yang sama atau identik dengan induknya, karena dalam proses pengkloningan terjadi pengambilan bagian dari induk yang kemudian akan ditumbuhkan menjadi individu baru yang sama persis dengan induknya. Selain itu, kloning juga dapat dimanfaatkan sebagai terapi atau pengobatan pada penderita diabetes, leukemia, kelumpuhan saraf, dan berbagai penyakit akibat kerusakan jaringan.

Teknik kloning dibagi menjadi dua, yaitu:

a.      Teknik Roslin

Penelitian ini dilakukan pada domba yang berumur dewasa, dan membuktikan bahwa sel binatang yang berumur dewasa dapat dikloning secara sempurna. Penelitian yang dilakukan oleh Ian Wilmut dan Keith Cambell menunjukkan tentang suatu metode yang mampu melakukan singkronisasi siklus sel dari kedua sel, yakni sel donor dan sel telur. Tahapan yang dilakukan pada penelitian dengan teknik Roslin, sebagai berikut:

-                Sel yang akan dijadikan sebagai sel donor diseleksi dari sel kelenjara mammae domba betina berbuluh putih (Finn Dorset) untuk menyediakan informasi genetis bagi pengklonan. Hal ini dilakukan dengan membiarkan sel tesebut membelah dan membentuk jaringan in vitro atau diluar tubuh hewan, sehingga dihasilkan duplikat yang banyak dari suatu inti yang sama.

-                Sel donor diambil dari jaringan dan dimasukkan ke dalam campuran yang hanya memiliki nutrisi yang cukup untuk mempertahankan kehidupan sel. Hal ini menyebabkan sel untuk menghentikan seluruh gen yang aktif dan memasuki stadium G0 atau stadium dorman. Lalu, sel telur domba betina Blakface (mukanya tertutupi bulu hitam) dienokulasi dan diletakkan disebelah sel donor.

-                Setelah pengambilan sel telur setelah satu sampai delapan jam, dilakukan kejutan listrik untuk menggabungkan dua sel tersebut. Pada saat yang sama pertumbuhan dari suatu embrio mulai diaktifkan. Jika embrio dapat bertahan maka embrio tersebut dapat ditumbuhkan dengan dibiarkan selama enam hari, diinkubasi di dalam ovinduk domba. Jika dari awal sel diletakkan di dalam ovinduk  makapertumbuhannya akan lebih mampu bertahan dibandingkan dengan embrio yang diinkubasi dalam laboratorium.

-                Embrio ditempatkan ke dalam uterus betina (surrogate mother). Induk betina tersebut mengandung hasil kloning tadi hingga hewan hasil kloning siap untuk dilahirkan.

b.   Teknik Honolulu

Tim ilmuwan yang terdiri dari Teruhiko Wakayama dan Ryuzo Yanagimachi dari Universitas Hawai (1998),  berhasil menghasilkan tiga generasi cloning dari ± seratus proses kloning yang secara genetik identik. Persentase keberhasilan teknik Honolulu lebih besar dari tingkat keberhasilan dengan teknik Roslin yang dilakukan oleh Ian Wilmut hanya sebesar 0,361 %. Ian Wilmut menggunakan sel dari kelenjar mammae yang harus masuk ke dalam stadia G0 secara paksa, sedangkan Teruhiko Wakayam dan Ryuzo Yanagimachi awalnya menggunakan beberapa tipe sel yaitu sel otak dan sel cumulus. Sel otak berada dalam stadis G0 secara alamiah dan sel cumulus hampir selalu ada pada stadia G0 ataupun G1.

Pada teknik ini, sel telur tikus yang tidak dibuahi digunakan sebagai penerima atau resipien dari inti donor. Setelah diinokulasi, sel telur (inti donor) dimasukkan ke dalam sel telur tikus dan sel-sel akan menerima nukleus-nukleus yang baru setelah satu jam. Kemudian sel telur ditempatkan pada sebuah kultur kimia dengan suatu substansi yang mampu menghentikan pembentukan suatu polar body. Polar body akan menjadikan jumlah dari gen dalam sel menjadi setengah dari jumlah gen sel normal. Setelah disatukan sel-sel berkembang menjadi embrio-embrio yang akan ditransplantasikan kepada induk betina donor (surrogate mother) hingga siap untuk dilahirkan. Dari kedua sel yang digunakan, sel yang paling berhasil dalam proses kloning adalah sel kumulus karena menghasilkan sel yang hidup.

Gambar 1. Tahapan proses kloningteknik Honolulu

2.2 Jenis-Jenis Kloning

Kloning adalah tindakan menggandakan atau mendapatkan keturunan tanpa fertilisasi, berasal dari induk yang sama, mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan kemungkinan besar mempunyai fenotip yang sama. Berdasarkan pengertian diatas, terdapat beberapa jenis kloning yang dikenal, antara lain :

1)      Kloning  DNA Rekombinan

Pada kloning DNA rekombinan, DNA asing dimasukkan ke dalam plasmid suatu sel bakteri. DNA tersebut akan bereplikasi (memperbanyak diri) dan diturunkan pada sel anak pada waktu sel tersebut membelah. Gen asing ini tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada dalam sel bakteri. Pembentukan DNA rekombinan ini disebut juga rekayasa genetika.Perekayasaan genetika terhadap satu sel dapat dilakukan dengan hanya menghilangkan, menyisipkan atau menularkan satu atau beberapa pasang basa nukleotida penyusun molekul DNA tersebut. Untuk kloning ini diperlukan plasmid dan enzim untuk memotong DNA, serta enzim untuk menyambungkan gen yang disisipkan itu ke plasmid. Plasmid dapat diintegrasikan (dimasukkan) ke dalam kromosom bakteri dan dapat dipindahkan dari satu sel bakteri ke bakteri yang lain melalui transformasi, jika kromosom sel-sel tersebut merupakan pasangannya. Plasmid yang pertama kali dipakai sebagai vektor untuk rekombinan DNA adalah plasmid dari sel bakteri Escherichia coli.Plasmid ragi Saccharomyces cerevisiae, dan plasmid bakteri Bacillus subtilis dan virus saat ini juga digunakan sebagai vektor untuk rekombinan DNA.

Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing atau DNA yang diinginkan, harus memenuhi hal-hal sebagai berikut: DNA plasmid vektor harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim yang sesuai sehingga terbuka, DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk membentuk rekombinan buatan harus dipotong dengan enzim yang sama, reaksi pemotongan dan penggabungan harus dipantau dengan menggunakan elektroforesis gel, rekombinan buatan harus ditransformasikan ke E. coli atau ke vektor lainnya.

2)      Kloning Kesehatan (Terapeutic Kloning)

Kloning terapeutik merupakan bagian dari terapi sel punca yang bertujuan untuk menghindari adanya reaksi penolakan terhadap sistem imun pasien pada saat dilakukan terapi. Kloning terapeutik dilakukan dengan sel induk yang berfungsi sebagai terapeutik (penyembuhan) dan riset medis, bukan untuk menciptakan manusia baru. Hal ini dilakukan dengan menggunakan teknologi SCNT (Somatic Cell Nuclear Transfer). Sel punca memiliki potensi yang sangat menjanjikan untuk terapi berbagai penyakit sehingga menimbulkan harapan baru untuk mengobatinya. Sampai saat ini, terdapat tiga kelompok penyakit yang dapat diatasi dengan penggunaan sel punca, yaitu penyakit autoimun, penyakit kanker, dan penyakit degenerative (seperti stroke, Parkinson, dan Alzhimer).

Tahapan untuk melakukan kloning terapeutik pada manusia, yaitu:

-          Biopsi sel somatik dari tubuh pasien diambil dan inti dari sel somatik tersebut ditransfer ke dalam sel telur donor yang telah dikeluarkan intinya (unfertilized enucleated oocyte)

-          Sel telur hasil manipulasi dikultur sampai ke tahapan tertentu dan setelah mengalami berbagai proses akan didapatkan sel punca embrionik. Sel punca embrionik akan diarahkan perkembangannya menjadi suatu jaringan atau organ tertentu yang dapat digunakan untuk transplantasi jaringan atau organ dan tidak akan mengalami rejeksi sistem imun pada pasien itu sendiri (immunologically compatible transplant)

-          DNA dari sel somatik pasien (yang berada di dalam injection pipette) diintroduksikan ke dalam sel telur enucleated.Sel telur hasil manipulasi dikultur secara in vitro menjadi blastosit selama 5-6 hari. Lalu,  inner cell mass diisolasi dan dikultur di cawan petri sehingga akan berkembang menjadi sel punca embrionik yang memiliki profil imunologi yang sama dengan pasien.

3)      Kloning Reproduksi (Reproductive Kloning)

Kloning reproduktif mengandung arti suatu teknologi yang digunakan untuk menghasilkan individu baru atau teknologi yang digunakan untuk menghasilkan hewan yang sama dengan menggunakan teknik SCNT. Kloning reproduktif pertama kali dilakukan oleh seorang Ilmuan Inggris (John Gurdon) yang berhasil melakukan kloning pada katak. Setelah itu, pada tahun 1996, Ian Wilmut dan para peneliti yang lain dari Roslin Institute di Edinburg (Skotlandia) berhasil menciptakan biri-biri yang diberi nama Dolly yang hanya bertahan hidup sampai umur 6 tahun. Penelitian ini dikatakan belum berhasil karena Dolly yang sebenarnya, harus mencapai umur 11 tahun. Tahapan pada kloning reproduktif, yaitu sel donor yang berupa sel somatik (2n) diintroduksikan ke enucleated oocyte. Kemudian, embrio dimplantasikan ke dalam rahim untuk dilahirkan secara normal, dimana embrio dikultur secara in vitro untuk didiferensiasikan menjadi berbagai jenis sel untuk kegunaan terapeutik atau kesehatan. Penelitian kloning reproduktif membutuhkan biaya yang sangat tinggi, tingkat kegagalannya tinggi, serta tingkat keberhasilan yang rendah. Hewan klon cenderung mengalami masalah defisiensi sistem imun serta sangat rentan terhadap infeksi, pertumbuhan tumor, dan kelainan-kelainan lainnya. Hal ini dikarenakan adanya kesalahan saat pemrograman material genetik (reprogramming) dari sel donor yang menyebabkan terjadinya perkembangan embrio yang abnormal.

2.3 Aplikasi Kloning

Salah satu aplikasi kloning dalam medis adalah pengembangan obat untuk anti tuberkulosis baru. Seperti yang telah diketahui, resistensi obat di Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) menjadi masalah global dalam beberapa tahun terakhir ini, dan munculnya resisten multi drug telah meningkatkan banyak angka kematian di seluruh dunia. Sampai saat ini belum ditemukan obat untuk penyakit tuberkulosis. Bahkan Mycobacterium bovis BCG (M. bovis BCG), vaksin anti-TB, yang dikembangkan oleh Calmette Guerin telah digunakan di seluruh dunia. Genom Mycobacteria terdiri dari sejumlah besar frame pembacaan terbuka (ORFs) yang mengkode protein dan berperan terhadap pertumbuhan atau kelangsungan hidup bakteri di dalam makrofag. Keberadaan Mycobacterial dalam makrofag menjadi tantangan terbesar untuk mengembangkan obat baru yang dapat melawan patogen. Sejauh ini, obat-obatan yang digunakan dalam pengobatan tuberkulosis hanya menargetkan bakteri yang aktif tumbuh. Selama infeksi, M. tuberculosis sangat bergantung pada metabolisme asam lemak baik untuk pasokan energi dan untuk sintesis biomolekul yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup di living host. Propionil-CoA yang dihasilkan dengan asetil-CoA selama pemecahan rantai asam lemak dan asam amino yang berpotensi sebagai racun untuk mikobakteri. Pada Mycobacteria, metabolisme propionil-CoA terkait dengan sintesis penting faktor virulensi lipid seperti phthiocerol dimycocerosate (PDIM) dan sulfolipid-1 (SL-1). M. tuberculosis memetabolisme propionil-CoA melalui siklus methylcitrate. Siklus methylcitrate mikobakteri terdiri dari 2-methylcitrate synthase (Rv1131) dan methylcitrate dehidratase (Rv1130) tapi tidak mengandung methylisocitrate lyase khusus (MCL).

Tabel 1. Macam-macam Primers

Primer name	Sequence details (5’- 3’) **
Rv1131 forward	ATTCCACCAGGATCCTTTCGATG
Rv1131 reverse	GAGAAAGCTTATGGCCCATAAGAG
T7 promoter	TAATACGACTCACTATAGGG
T7 terminator	CTAGTTATTGCTCAGCGGTG

** Restriction sites in the primer have been underlined.

Adaptasi metabolik diperlukan dalam jangka waktu yang panjang dari Mycobacteria pada host. M. tuberculosis yang mengubah sumber energi dari glukosa menjadi asam lemak karena memiliki kemampuan untuk menginduksi pembentukan makrofag dengan jumlah lipid yang banyak. Siklus Methylcitrate, yang memungkinkan M. tuberculosis untuk memanfaatkan asam lemak, telah diidentifikasi sebagai potensi jalur metabolisme yang dapat ditargetkan dengan obat baru. Oleh karena itu, untuk mengembangkan obat anti tuberkulosis baru dengan menargetkan enzim sintase 2-methylcitrate, perlu dilakukan kloning gen Rv1131 pada E. Coli terlebih dahulu. Adapun tahapan kloning gen Rv1131, yaitu gen Rv1131 diamplifikasi dengan PCR, sehingga dapat diperoleh sebuah fragmen DNA 1,2 kb yang mengandung open reading frame dari 393 asam amino. Gen tersebut kemudian dikloning ke pGEM-T vektor mudah dan disaring dengan menggunakan metode blue/white screening. Urutan plasmid rekombinan positif diverifikasi oleh sekuensing DNA. Plasmid rekombinan positif dicerna dengan enzim restriksi BamH I dan Hind III dan produk gen adalah gel dimurnikan dan diikat dengan vektor pET28c (dicerna dengan enzim yang sama) dan berubah menjadi E. coli DH5α. Koloni disaring discreen dengan metode PCR menggunakan promotor T7 dan terminator primer T7 untuk mengidentifikasi koloni rekombinan. Plasmid rekombinan diisolasi dari koloni positif menggunakan enzim restriksi BamH I dan Hind III. Dalam hal ini digunakan vektor pET28c, karena vektor tersebut mengandung N-terminal 6 x His Tag yang dimurnikan dengan Nickel affinity chromatography.

3. Kesimpulan

Kloning merupakan salah satu bioteknologi yang bertujuan untuk mendapatkan keturunan yang sama atau identik dengan induknya. Kloning dapat dilakukan pada manusia, hewan dan tanaman.Sel yang dapat digunakan untuk dikloning dapat berupa sel oosit, sel otak, sel cumulus dan lain-lain.Umumnya terdapat dua teknik dapat proses kloning yaitu teknik Roslin dan teknik Honolulu yang mana kedua teknik tersebut mampu menghasilkan klon yang sama dengan induknya. Salah satu manfaat dari kloning adalah dapat memperbanyak bibit dan melestarikan spesies. Selain itu, dampak negative dari kloning adalah merubah salah satu sel yang ada didalam tubuh jika proses tersebut gagal dan dapat menimbulkan penyakit dari penyatuan sel tetapi dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi maka sehingga banyak dilakukan penelitian tentang kloning.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Anam, Khairul. 2009. DNA Rekombinasi. Institut Pertanian Bogor. Bogor

[2] Budiani, Asmini, dkk. 2006. Aktivitas ACCase mesokarp kelapa sawit dan kloning fragmen gen penyandi ACCase subunit biotin karboksilase, 74 (1), 33-43

[3] Ciptadi, Gatot. 2007. Pemanfaatan Teknologi Kloning Hewan Untuk Konservasi Sumber Genetik Ternak Lokal Melalui Realisasi Bank Sel Somatis, Vol. 6, No. 2; 60-65

[4] Eniyan, K. And Urmi B. 2015. Kloning, expression, purification and bioinformatic analysis of 2-methylcitrate synthase from Mycobacterium tuberculosis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 19-23

[5] Hartati, Sri, dkk. 2004. Kloning dan Ekspresi Gen Penyandi Sagi Toxoplasma gondii Isolat Lokal pada Vektor PGEX-2T. UGM. Yogyakarta

[6] Khodadadi, E. dkk. 2015. Kloning and expression of full‑length human insulin‑like growth factor binding protein 3 (IGFBP3) in theEscherichia coli. Kloning of IGFBP3. IP: 114.79.28.190

[7] Subekti, Didik, dkk. 2007. Kloning Dan Analisis Hasil Kloning Gen GRA1 dari Takizoit Taxoplasma gondii Isolat Lokal. UGM. Yogyakarta

[8] Zhang, H. Dkk .2015 . Kloning, expression and antiviral activity of mink alpha-interferons. BMC Veterinary Research11:42