immunocytochemistry pada Sel kanker paru paru

IDENTIDIKASI SEL KANKER PARU PARU

DENGAN IMUNOSITOKIMIA

Oleh: Izzatul Lailiyah

Jakarta, ANTARA news pada 2015 lalu menyatakan bahwa kanker menduduki peringkat 7 penyebab kematian di seluruh dunia. Kanker terjadi karena siklus sel yang tidak normal, sehingga menyebabkan sel tumbuh dan membelah secara terus menerus, menyerang sel lain, dan bermigrasi ke organ lain melalui darah dan cairan limfa. Salah satu jenis kanker yang banyak diderita masyarakat Indonesia adalah kanker paru-paru.

Kanker paru-paru merupakan penyakit dengan ciri khas adanya pertumbuhan sel yang tidak terkontrol pada jaringan paru-paru. Bila tidak dirawat, pertumbuhan sel ini dapat menyebar ke luar dari paru-paru melalui suatu proses yang disebut metastasis ke jaringan yang terdekat atau bagian tubuh yang lainnya. Jenis kanker paru yang utama adalah SCLC (kanker paru-paru sel kecil) dan NSCLC (kanker paru-paru non sel kecil. Adapun gejala yang paling umum diderita pada penderita stadium awal adalah batuk-batuk, sesak napas, dan berat badan menurun drastik. Penyebab kanker paru-paru bermacam-macam, salah satunya merokok, polusi udara, genetika, ataupu terpapar radiasi ionisasi.

Salah satu teknik untuk mengidentifikasi sel kanker pada paru-paru adalah imunositokimia. Imunositokimia adalah metode yang menggunakan antibodi untuk mengidentifikasi protein atau molekul dalam sel yang dapat dilihat dengan mikroskop (Burry, Richard. 2010). Imunositokimia juga diartikan sebagai suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi primer spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Pada kesempatan ini, penulis tertarik untuk membahas mengenai imunositokimia yang diaplikasikan untuk identifikasi sel kanker dengan judul “ Immunocytochemistry pada Sel Kanker Paru-paru”

A. IMUNOSITOKIMIA

Imunositokimia adalah metode yang menggunakan antibodi untuk mengidentifikasi protein atau molekul dalam sel yang dapat dilihat dengan mikroskop (Burry, Richard. 2010). Imunositokimia juga diartikan sebagai suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi primer spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen. Antibodi primer spesifik ini mampu memvisualisasi protein di bawah mikroskop fluorescence, ketika dia berikatan dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasi dengan fluorophore (sejenis kromofor/fluorocence). Kelebihan dari imunositokimia ini adalah peneliti dapat mengamati apakah sel dalam sampel mengekspresi antigen yang dimaksud. Selain itu juga peneliti dapat menentukan sel apakah yang menunjukkan ekspresi antigen.

Berdasarkan sampel dan proses pengujian sampel, imunositokimia berbeda dengan imunohistokimia. Pada imunositokimia pengamatan yang dilakukan adalah terhadap sel sedangkan imunohistokimia adalah pengamatan terhadap jaringan. Adapun, perbedaan antara imunsitokimia dan imunohistokimia ditunjukkan pada tabel 1 berikut.

B. PROSEDUR IMUNOSITOKIMIA

Secara umum prosedur imunositokimia meliputi proses fiksasi, pengambilan antigen, permeabilisasi, imunostaining, counter staining, dan mounting.

1.        Fiksasi

• Fix sampel le dalam methanol dingin/ aseton (1 – 10 menit)/ 3 – 4%  paraformaldehid dalam PBS pH 7,4 (pilih salah satu) 
• Dibilas sampel dengan PBS dingin sebanyak 2 kali 

2.        Pengambilan antigen

Antibodi tertentu bekerja dengan baik ketika sel dipanaskan dalam antigen retrieval buffer. Sebaiknya dipelajari lebih dulu mengenai data produk untuk rekomendasi tiap antibodi yang digunakan

• Dipanaskan antigen retrieval buffer (100 mM tris, 5% (w/v) urea, pH 9,5) sampai 95⁰C. Pemanasan dilakukan dalam botol staining yang dimasukkan ke dalam water bath dengan suhu 95⁰C.
• Dimasukkan cover slip ke dalam antigen retrieval buffer. Sebelumnya diberi catatan bagian cover slip yang berisi sel 
• Dipanaskan coverslip pada 95⁰C selama 10 menit, kemudian diambil 
• Direndam dalam PBS (pada cawan petri) dengan bagian yang berisi sel menghadap ke atas selama 5 menit, sebanyak 3 kali

3.        Permeabilisasi

Apabila protein target terletak di intrasel, maka sangat penting untuk melakukan permebilisasi

• Sampel diinkubasi selama 10 menit dengan PBS yang mengandung 0,25% Triton X-100 (atau 100 µM digintonin / 0,5% saponin). Triton X-100 merpakan detergen yang mampu meningkatkan proses penitrasi antibody ke dalam sel 
• Dicuci sel dalam PBS selama 5 menit, sebanyak 3 kali

4.        Imunostaining

• Diinkubasi sel dengan 1% BSA dalam PBST selama 30 menit untuk memblokir antibody non spesifik (untuk rekomendasi jenis blocking yang digunakan, sebaiknya dilihat data produk)
• Diinkubasi sel dalam antibody primer (dalam 1% BSA dalam PBST) selama 1 jam pada suhu kamar atau semalam pada suhu 4⁰C 
• Dituang larutan-kemudian dicuci sel dalam PBS selama 5 menit, sebanyak 3 kali
•  Diinkubasi sel dalam antibodi sekunder (dalam 1% BSA) selama 1 jam di ruang gelap dengan suhu kamar 
• Dituang larutan antibody sekunder dan dicuci selama 5 menit, sebanyak 3 kali dalam ruang gelap

5.        Counter staining

• Diinkubasi sel dalam 0,1-1 µg/ml DNA stain selama 1 menit
• Dicuci dengan PBS

6.        Mounting

• Coverslip dimounting kemudian di simpan di tempat gelap pada suhu -20⁰C sampai 4⁰C

C. APLIKASI IMUNOSITOKIMIA

Contoh aplikasi imunositokimia ini merunut dari 3 jurnal yang membahas penerapan imunositokimia dalam menganalisis sel kanker paru paru. Sel kanker merupakan sel-sel yang tumbuh dan membelah secara tidak teratur dengan kecepatan tinggi. Salah satu jenis kanker dengan resiko kematian tinggi adalah kanker paru-paru. Kanker paru-paru adalah salah satu penyebab kematian terbesar di seluruh dunia (Sinna, Noha, and Ghada, 2013). Kanker paru-paru non sel kecil (Non Small Cell Lung Cancer-NSCLC) adalah jenis kanker yang paling umum didiagnosis pada penderita kanker paru-paru. NSCLC diklasifikasikan menjadi 3 tipe histologi yaitu adenokarsinoma, karsinoma sel skuamosa, dan karsinoma sel besar. Salah satu cara dalam mengamati perkembangan sel kanker paru-paru adalah dengan imunositokimia. Contoh penerapan imunositokimia adalah pada identifikasi sel kanker.

1. Identifikasi NSCLC (Non Small Cell Lung Cancer) dengan mutasi EGFR (Epidermal Growth Factor  Receptor)

Pada penelitian Kawahara et al. (2011) ini, sampel diambil dari cairan serebrospinal (cairan pada bagian otak dan akord tulang belakang) dan cairan paru paru pada 24 orang pasien penderita NSCLC. Jenis antibodi yang digunakan dalam imunositokimia ini adalah

·   Antibody primer: anti mutasi EGFR yang mengenali mutasi delE746-A750 di exon 19 dan mutasi L858R di exon 21

·      Antibody sekunder: HRP antibody yang dilabel polimer

 

Hasil imunositokimia sel kanker pada sampel cairan paru-paru adalah sebagai berikut. 

Gambar 1. Hasil imunositokimia pada cairan paru-paru

Gambar A dan B menunjukkan reaksi positif dengan antibodi anti delE746-A750 dan anti L858R. Hasil ini menyatakan adanya mutasi EGFR. Sedangkan gambar C menunjukkan hasil negatif dengan antibodi anti delE746-A750 atau anti L858R karena tidak adanya mutasi EGFR.

Hasil imunositokimia sel kanker pada sampel cairan serebrospinal ditunjukkan oleh gambar 2. Hasil positif ditunjukkan oleh gambar B yang menunjukkan reaksi dengan anti-L858R.

Gambar 2. Hasil imunositokimia pada cairan serebrospinal

 

 DAFTAR PUSTAKA

Burry, Richard W., 2010. Immunocytochemistry: A Practical Giude for Biomedical Research. Springer-Verlag New York

Kawahara, Akihiko et al., 2011. Identification of non-small-cell lung cancer with activating EGFR mutations in malignant effusion and cerebrospinal fluid: Rapid and sensitive detection of exon 19 deletion E746-A750 and exon 21 L858R mutation by immunocytochemistry. Journal Lung Cancer 74 (2011): 35-40

Sinna, Eman A., Noha Ezzat, Ghada M. Sherif, 2013. Role of thyroid transcription factor-1 and P63 immunocytochemistry in cytologic typing of non-small cell lung carcinomas. Journal of the Egyptian National Camcer Institute (2013) 25: 209-218