Modifikasi Kimia SOD pada Lipid Peroksidasi dan Antioksidan pada Tikus Diabetes

Nur Lailah

Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya

REVIEW from

1.      Pendahuluan

Diabetes mellitus (DM) didefinisikan sebagai gangguan metabolisme kronis. DM mempengaruhi lebih dari 346 juta orang di seluruh dunia dan jumlah ini diperkirakan akan meningkat dua kalinya pada tahun 2030 [1,2]. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa generasi spesies oksigen reaktif dan radikal bebas meningkat dan/atau menurunnya potensi pertahanan antioksidan dalam pasien dengan diabetes mellitus [2,3].. Penelitian lain menunjukkan bahwa DM berhubungan dengan stres oksidatif, yang menyebabkan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS), termasuk hidrogen peroksida (H₂O₂), radikal superoksida (O2^{• -}), dan radikal hidroksil (OH^•) atau pengurangan sistem pertahanan antioksidan [2,4].. Keseimbangan antara generasi radikal dan sistem radikal sangat penting dalam DM [5].

SOD, Cu, Zn jenis [EC 1.15.1.1] mengkatalisis dismutasi anion superoksida radikal (O₂^•-) yang sangat reaktif untuk menjadi molekul oksigen (O₂) dan hidrogen peroksida (H₂O₂), yang kemudian dikonversi menjadi molekul oksigen dan air dengan enzim katalase [6,7].Telah lama diketahui bahwa spesies oksigen reaktif yang berlebihan dapat menyebabkan penyakit kanker, diabetes dan penyakit inflamasi, serta berbagai penyakit kardiovaskular [8,9]. Enzim SOD sangat penting dalam menurunkan radikal superoksida dan karenanya dapat membantu melindungi sel-sel terhadap produk sampingan yang beracun dari metabolisme aerobik. Namun, SOD memiliki plasma waktu paruh yang pendek pada in vivo (kurang dari 5 menit) hal ini akan membatasi aplikasi klinis dari enzim ini [10,12]. Selain itu, SOD dengan cepat dinonaktifkan oleh produk reaktifnya sendiri H₂O₂, dan menghasilkan ROS yang sangat reaktif [10,13].

Berbagai strategi telah dikembangkan untuk meningkatkan intravaskular waktu paruh SOD [6,8,10–12,14–15]. Dikarenakan profil farmakokinetik yang rendah [11,12,16], dan waktu paruh yang pendek dalam sistem biologi [17], pengendalian pengiriman strategi baru telah diteliti. Transformasi kimia pada permukaan protein dengan pelarut air polimer sintetis telah dilaporkan sebagai pendekatan yang berguna untuk meningkatkan sifat farmakologi dan farmakokinetik SOD [15]. Berbagai polimer alami dan sintetis telah digunakan sebagai agen kimia untuk memodifikasi protein [18] dan enzim antioksidan. Beberapa konjugat Cu, Zn-SOD dikembangkan termasuk poli (vinlypyrrolidone) (PVP), polietilen glikol (PEG), karboksimetilselulosa (CMC), CM-dekstran, DIVEMA (divinly eter dan maleat anhyride), poli [N (2hydroxypropyl) metakrilamida) (PHPMA) [11,19,20] dalam literatur.

Bagaimanapun, pengaruh modifikasi kimia SOD dengan poly metil vinil eter-co-maleat anhidrida (PMVE / MA) dan CMC polymers belum dilaporkan terhadap tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin. PMVE / MA memiliki potensi besar dalam aplikasi biomedis karena sifat-sifatnya yang biodegradable dan biokompatibel [21]. Demikian pula, CMC adalah polimer anionik alami yang biodegradable dan biocompatible [22] dan memiliki beberapa potensi dalam aplikasi ilmu pengetahuan biomedis [23].

2. Hasil dan Pembahasan

Penelitian ini didesain untuk membandingkan efek SOD yang asli dan SOD yang dimodifikasi secara kimia dengan polimer pada peroksidasi lipid dan status antioksidan pada tikus diabetes yang diinduksi dengan STZ.

2.1. Karakterisasi konjugat SOD-CMC dan SOD-PMVE / MA dengan kromatografi  eksklusi ukuran

Prosedur konjugasi carbodiimide diikuti dengan konjugat-polimer untuk memperoleh konjugat polimer SOD seperti yang dijelaskan sebelumnya. SOD-PMVE/MA atau SOD-CMC kemudian dikonjugasi pada rasio berat polimer yang berbeda/SOD 16, 24, 32 menggunakan EDC yang larut dalam air sebagai zero-lengthcross-linker.

Semua konjugat yang dikarakterisasi dengan SEC bertujuan untuk mengidentifikasi apakah konjugasi terjadi secara sempurna. Informasi rinci konjugat polimer SOD tentang sifat-sifat fisikokimia diperoleh menggunakan detektor SEC, RI dan RALS yang sensitif terhadap masing-masing konsentrasi dan massa molar, sedangkan detektor absorbansi UV sensitif terhadap kandungan protein sampel [24]. Kromatogram SEC dari SOD dan konjugat polimer SOD dengan PMVE/MA (Gambar 2.1) dan CMC (Gambar 2.2) menunjukkan konsentrasi SOD yang sama sebesar 2,5 mg/mL dalam semua larutan. Pada Gambar.2.1, konjugat SOD-PMVE/MA (1, 2 atau 3) dan SOD dalam sistem (5) diberi label pada kromatogram SEC. Sebagaimana ditunjukkan pada Gambar 2.1, semua  kromatogram SOD yang diperoleh dari detektor yang berbeda, puncak elusi pada 18,27 mL disebabkan adanya SOD. Ketika reaksi konjugasi terjadi, ada puncak baru muncul (1, 2 atau 3) yang dielusi  antara 10 dan 17,5 mL dan dideteksi dengan detektor UV (Gambar 2.1 B). Hal ini menunjukkan bahwa konjugasi antara gugus karboksil PMVE/MA dan gugus amino dari enzim SOD terjadi secara sempurna.

Pada Gambar 2.2 hasil yang sama untuk konjugasi CMC-SOD diperoleh dari analisis SEC. Sebagai hasil reaksi konjugasi, molekul yang lebih besar (konjugat SOD-CMC) disintesis dan molekul-molekul dielusi dari kolom lebih awal dari pada molekul CMC dan SOD seperti yang terlihat pada Gambar 2.2B.

Berdasarkan Gambar. 1 dan 2, nilai luas puncak yang diperoleh dengan detektor UV, RI dan RALS jelas meningkat dengan meningkatnya perbandingan berat molekul polimer/SOD (16, 24, 32). Sinyal RI semua molekul berbanding lurus dengan dn/dc dan konsentrasi. Nilai polimer dn/dc umumnya terkait dengan komposisi kimianya. Nilai dn/dc polimer adalah secara umum berhubungan dengan komposisi kimianya. Dalam kromatogram RALS, daerah puncak konjugat meningkat dengan meningkatnya konsentrasi polimer yang digunakan dalam reaksi konjugasi, seperti yang terlihat pada Gambar 2.1 C dan 2.2 C. Sinyal hamburan cahaya berhubungan dengan berat molekul dan konsentrasi molekul dan peningkatan dalam daerah puncak kromatogram RALS merupakan modifikasi SOD dengan PMVE/MA atau CMC secara kimia.

Gambar 2.1 SOD-PMVE/MA Konjugasi

Gambar 2.2 SOD-CMC Konjugasi

Selain itu, kami meneliti efek dari modifikasi kimia SOD pada aktivitas tertentu menggunakan metode xanthine oksidase dan xanthine dan hasil yang diperoleh ditunjukkan pada Tabel 1. Mengenai hasil aktivitas spesifik; diamati bahwa aktivitas enzimatik konjugat SOD-polimer adalah kurang dari SOD : SOD-PMVE/MA tetap 87,12% dari aktivitas SOD asli, sedangkan SOD-CMC mempertahankan 91,3% aktivitas spesifik konjugat sangat maksimal dibandingkan dengan SOD asli.

2.2. Stabilitas Konjugat SOD-CMC dan SOD-PMVE /MA

Dalam penelitian ini, stabilitas enzim konjugat PMVE/MA-SOD dan CMC-SOD terhadap suhu atau H₂O₂ yang ditambahkan secara eksternal diuji. Stabilitas suhu SOD adan SOD yang dimodifikasi secara kimia ditentukan dari 40 sampai 95^ºC selama 5 menit (Gambar 2.3A). Kedua konjugat PMVE/MA-SOD dan CMC-SOD menunjukkan stabilitas suhu yang lebih baik daripada SOD.

Terhadap stabilitas eksternal ditambahkan 0,4 mM H₂O₂ menunjukkan Gambar 2.3B. Sebagian besar konjugasi polimer SOD menjadi lebih stabil terhadap H₂O₂ dari SOD; kecuali konjugat SOD-CMC yang memiliki perbandingan berat molekul 16 dan 24. Menurut hasil ini, kita dapat mengasumsikan bahwa konjugat PMVE/MA-SOD lebih stabil daripada konjugat SOD-CMC terhadap H₂O₂ yang ditambahkan secara eksternal.

Gambar 2.3 Kestabilan Enzim SOD Native dan SOD Konjugasi Polimer

2.3 Pengaruh konjugat SOD-CMC dan PMVEMA-SOD pada Kadar MDA dalam jaringan otak, ginjal dan hati

Seperti dilihat pada Tabel 2, tingkat MDA meningkat di otak, ginjal dan hati pada tikus kontrol diabetes (Grup II) bila dibandingkan dengan kontrol normal (kelompok I) dan SOD asli (Kelompok III) atau konjugat SOD ( Kelompok IV dan V) pada keompok yang diterapi (p <0,016). Konsentrasi produk peroksidasi lipid dalam jaringan, yang merupakan produksi tidak langsung radikal bebas yang berlebihan, meningkat pada tikus diabetes yang diinduksi STZ [2,25–27]. Selanjutnya peningkatan kadar MDA yang sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya dalam literatur [26,27]. Dengan demikian, tingkat MDA meningkat pada diabetes melitus menunjukkan bahwa hiperglikemia menginduksi reaksi lipid peroksidasi[26,27].. Namun, pengobatan dengan konjugat SOD-PMVE/MA secara signifikan (p <0,01) menurunakan kadar MDA bila dibandingkan dengan kontrol kedua (kelompok I dan II), kelompok native dan konjugat CMC-SOD (Kelompok III, IV) pada jaringan otak.

Pengobatan dengan konjugat PMVE/MA-SOD memiliki efek yang terbaik dari kadar MDA pada tikus diabetes yang diinduksi dengan STZ pada otak, ginjal dan hati bila dibandingkan dengan kelompok kontrol diabetes (Group II) (p <0,01, p <0,004 dan p <0,004, masing-masing). Oleh karena itu, kita dapat mengatakan bahwa SOD yang dimodifikasi secara kimia dengan PMVE/MA mampu mencegah peroksidasi lipid pada tikus diabetes yang dinduksi dengan STZ pada otak, ginjal dan hati. Konjugat PMVE/MA-SOD bisa dijadikan sebagai obat terapi baru untuk cedera peroksidasi lipid.

2.4. Pengaruh konjugat SOD-CMC dan PMVE/MA-SOD terhadap Kadar GSH dalam jaringan otak, ginjal dan hati

Tingkat antioksidan non-enzimatik (GSH) dalam otak, ginjal dan hati ditunjukkan pada Tabel 3. Dapat dilihat bahwa kadar GSH secara signifikan menurun pada tikus diabetes yang diinduksi dengan STZ bila dibandingkan dengan tikus kontrol normal. Aktivitas GSH dari kelompok SOD yang diterapi dengan dimodifikasi secara kimia secara signifikan lebih tinggi dibandingkan pada kedua kelompok kontrol (Grup I dan II) (p <0,004, p <0,004) tikus diabetes. Akan tetapi, tidak ada pengaruh yang signifikan dari konjugat PMVE/MA-SOD atau CMC-SOD dalam jaringan otak. Aktivitas GSH meningkat mungkin sebagai respon adaptif terhadap stres oksidatif yang meningkat pada tikus diabetes yang diinduksi STZ [49]. Pada pemberian polimer-SOD kadar MDA menurun dan tingkat GSH meningkat. Hal ini menunjukkan bahwa dengan adanya SOD yang dimodifikasi secara kimia memiliki efek perlindungan dalam pengembangan komplikasi stres oksidatif.

2.5. Pengaruh konjugat SOD-CMC dan PMVE / MA-SOD pada tingkat SOD di otak, ginjal dan jaringan hati

Tabel 4 menunjukkan aktivitas enzim antioksidan (SOD) dalam tikus diabetes  yang dinduksi dengan STZ pada otak, ginjal dan hati. Dalam kelompok kontrol diabetes (Grup II) aktivitas SOD otak secara signifikan menurun bila dibandingkan dengan kelompok kontrol normal (p <0,004), sedangkan tingkat aktivitas SOD hati meningkat. SOD native pada tikus diabetes diterapi (Group III), kadar SOD ginjal dan hati secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kedua kelompok kontrol (p <0,004, keduanya). Juga, pengobatan dengan konjugat SOD-CMC (Group IV) memiliki efek kadar SOD terbaik, bila dibandingkan dengan kelompok tikus kontrol diabetes (Kelompok II) (p <0,01, p <0,004 dan masing-masing p <0,004) tikus diabetes yang diinduksi dengan STZ.

SOD adalah enzim pelindung penting yang mempercepat dismutasi radikal anion superoksida menjadi hidrogen peroksida sebagai pertahanan utama [5]. Tetapi tidak ada penurunan di tingkat enzim antioksidan di banyak organ pada tikus diabetes [26]. Meskipun beberapa penelitian melaporkan penurunan aktivitas enzim SOD pada diabetes mellitus [28,29], beberapa penelitian lain menunjukkan peningkatan aktivitas enzim ini pada tikus diabetes yang diinduksi STZ [30,31]. Keseimbangan antara oksidan dan antioksidan sistem sangat penting dalam patogenesis diabetes mellitus dan pada  perkembangan cedera jaringan.

3. Kesimpulan

1.    Diabetes mellitus pada tikus adalah model yang berguna untuk mengamati efek perlindungan dari agen-agen yang diselidiki secara cepat pada kerusakan yang disebabkan oleh diabetes.
2.  Telah dijelaskan bahwa tingkat peroksidasi lipid dan stres antioksidan meningkat pada diabetes mellitus [26]. Penelitian ini merupakan studi pertama dari enzim SOD yang terkonjugasi dengan polimer PMVE/MA dan sifat fisikokimia konjugat ini dikarakterisasi denan kromatografi SEC.
3.   Selain itu, untuk pertama kalinya, konjugat SOD-CMC dan SOD-PMVE / MA digunakan terhadap komplikasi stres oksidatif pada diabetes mellitus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa modifikasi kimia meningkatkan resistensi enzim terhadap suhu dan oksidatif dalam aktivasi oleh H2O2.
4. .  Pengobatan dengan SOD yang dimodifikasi secara kimia mengurangi tingkat peroksidasi lipid dan meningkatkan status antioksidan pada tikus diabetes yang dinduksi dengan STZ.

DAFTAR PUSTAKA

[1] O. Egemen, O. Ozkaya, M.B. Ozturk, E. Sen, M. Akan, D. Sakiz, C. Aygit, J. HandMicrosurg. 4 (2012) 60–64.

[2] V. Ramachandran, R. Saravanan, J. Funct. Foods 5 (2013) 1077–1087.

[3] S. Rajasekaran, K. Sivagnanam, S. Subramanian, Pharmacol. Rep. 57 (2005)90–96.

[4] M.M. Sklavos, S. Bertera, M.T. Hubert, R. Bottino, J. He, J.N. Beilke,M.G. Coulombe, R.G. Gill, J.D. Crapo, M. Trucco, Diabetes 59 (2010)1731–1738.

[5] E. Erarslan, C. Türkay, B. Uz, A. Kaya, C. Koca, R. Bayrak, Ö. Alıcı, New J. Med. 27(2010) 106–112.

[6] Y. Kojima, A. Haruta, T. Imai, M. Otagiri, H. Maeda, Bioconjug. Chem. 4 (1993)490–498.

[7] K.L. Brigham, Chest 89 (1986) 859–863.

[8] Z.J. Zhan, Z.G. Zhou, W.G. Shan, Biochemistry (Moscow) 74 (2009)1266–1269.

[9] I.K. Adiga, R.R. Nair, Cell Biochem. Funct. 26 (2008) 346–351.

[10] A. Dominguez, A. Valdivia, J. Caballero, R. Villalonga, G. Martinez, E.H. Schacht,J. Bioact. Compat. Pol. 20 (2005) 557–570.

[11] V. Subr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Hirano, T. Kondo, T. Todoroki, M. Jelinkova, B.Rihova, J. Bioact. Compat. Pol. 17 (2002) 105–122.

[12] M.L. Corvo, J.C.S. Jorge, R. van’t Hof, M.E.M. Cruz, D.J.A. Crommelin, G. Storm,Bba-Biomembranes 1564 (2002) 227–236.

[13] S.L. Jewett, A.M. Rocklin, M. Ghanevati, J.M. Abel, J.A. Marach, Free Radic. Biol.Med. 26 (1999) 905–918.

[14] Y. Kojima, T. Akaike, K. Sato, H. Maeda, T. Hirano, J. Bioact. Compat. Pol. 11(1996) 169–190.

[15] Y. Perez, A. Valdivia, L. Gomez, B.K. Simpson, R. Villalonga, Macromol. Biosci. 5(2005) 1220–1225.

[16] G. Jadot, A. Vaille, J. Maldonado, P. Vanelle, Clin. Pharmacokinet. 28 (1995)17–25.

[17] T. Kondo, H. Terajima, T. Todoroki, T. Hirano, Y. Ito, T. Usia, K. Messmer, J. Surg.Res. 85 (1999) 26–36.

[18] K. Kizilbey, S. Derman, Z. Mustafaeva, J. Chem. Soc. 35 (2013) 1191–1196.

[19] D. Oupick´y, K. Ulbrich, B.ˇRíhová, J. Bioact. Compat. Pol. 14 (1999) 213–231.

[20] K. Ulbrich, J. Strohalm, D. Plocová, D. Oupick´y, V. Subr, J. Soucek, P. Poucková, J.Matouˇsek, J. Bioact. Compat. Pol. 15 (2000) 4–26.

[21] A.-Z. Chen, G.-Y. Wang, S.-B. Wang, J.-G. Feng, Y.-G. Liu, Y.-Q. Kang, Materials 5(2012) 1841–1852.

[22] J. Liuyun, L. Yubao, X. Chengdong, J. Biomed. Sci. 16 (2009) 65.

[23] A. Bajpai, A. Mishra, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 19 (2008) 2121–2130.

[24] H. Kong, J. Yang, Y. Zhang, Y. Fang, K. Nishinari, G.O. Phillips, Int. J. Biol. Macro-mol. 65 (2014) 155–162.

[25] A. Maritim, R. Sanders, J. Watkins III, J. Nutr. Biochem. 14 (2003)288–294.

[26] H.R. Yilmaz, E. Uz, N. Yucel, I. Altuntas, N. Ozcelik, J. Biochem. Mol. Toxicol. 18(2004) 234–238.

[27] T. Hünkar, F. Aktan, A. Ceylan, C. Karasu, Cell Biochem. Funct. 20 (2002)297–302.

[28] Y.G. Özkaya, A. Agar, P. Yargic¸ oglu, G. Hacioglu, S. Bilmen-Sarikc¸ ioglu, I. Özen,Y. Alicigüzel, Diabets Metab. 28 (2002) 377–384.

[29] S.A. Wohaieb, D.V. Godin, Diabetes 36 (1987) 1014–1018.

[30] Y. Aliciguzel, I. Ozen, M. Aslan, U. Karayalcin, J. Lab. Clin. Med. 142 (2003)172–177.

[31] W.-C. Huang, S.-W. Juang, I. Liu, T.-C. Chi, J.-T. Cheng, Neurosci. Lett. 275 (1999)25–28.